18種氨基酸分析方法
一. 儀器及試劑
儀 器：
1). 天平一臺 (精度 0. 1mg) ；
2). 恒溫水浴鍋一臺；
3). 容量瓶；
4). 試管(1.5×15cm 或 1.5×10cm) ；
5). 微量進樣器 (5μL 或 10 μL) 一支；
6). 微量可調移液槍 (1000u μL ，200 μL) 一支、吸頭多個；
7). 旋渦混勻器一臺；
8). HPLC 系統及氨基酸分析專用柱 (4.6×250mm 5 μm) ；
試 劑：
1). 超純水 (≥18MΩ?cm ) ；
2). 乙腈 (HPLC 級) ；
3). 三水合醋酸鈉 (分析純) ；
4). 冰醋酸 (分析純) ；
5). 衍生試劑 A 和衍生試劑 B 溶液，至于冰箱保存 (衍生試劑包對身體有害，用時請做好防護措施) ；
6). 正己烷 (HPLC 級) 。
7). 0.1mol/L 鹽酸溶液：量取 9.0mL 濃鹽酸，加去離子水稀釋至 1000mL。
8).正亮氨酸內標溶液：稱取正亮氨酸約 10mg，加 0.1mol/L 鹽酸溶液 10mL溶解，混勻。
二. 流動相的配制
色譜柱：CH 氨基酸專用柱 Amino Acid 5um 4.6X250
流動相A：0.1mol/L 醋酸鈉溶液 (pH 6.5) ：乙睛＝93.0：7.0
配制方法：準確稱取三水合醋酸鈉 13.6g 于 1000mL 水中，攪拌均勻，使之溶解，用冰醋酸或氫氧化鈉溶液調 pH值至 6.50；準確量取配制好的三水合醋酸鈉溶液930mL和乙腈70mL，混合均勻，抽濾過 0.22μm 濾膜；
流動相B：水：乙腈＝20.0：80.0
配制方法：準確量取水 200mL 和乙腈 800mL，混合均勻，抽濾過 0.22μm 濾膜；
三. 衍生化反應
1. 對照品溶液濃度值
Name | M.W. | C( μmol/mL) | Name | M.W. | C( μmol/mL) |
門冬氨酸 | 133. 10 | 2.50 | 胱氨酸 | 240.3 | 1.25 |
谷氨酸 | 147. 13 | 2.50 | 氯化銨 | 53.49 | 2.50 |
絲氨酸 | 105.09 | 2.50 | 酪氨酸 | 181. 19 | 2.50 |
甘氨酸 | 75.067 | 2.50 | 纈氨酸 | 117. 15 | 2.50 |
組氨酸 | 155. 15 | 2.50 | 蛋氨酸 | 149.21 | 2.50 |
精氨酸 | 174.20 | 2.50 | 異亮氨酸 | 131. 17 | 2.50 |
蘇氨酸 | 119. 12 | 2.50 | 亮氨酸 | 131. 17 | 2.50 |
丙氨酸 | 89.093 | 2.50 | 苯丙氨酸 | 165. 19 | 2.50 |
脯氨酸 | 115. 13 | 2.50 | 賴氨酸 | 146. 19 | 2.50 |
2. 供試品溶液制備
精密量取/稱取供試品適量，并配制成相應濃度的溶液備用。
3. 衍生步驟
1) 分別將A 、B 兩種衍生試劑用稀釋劑稀釋至原來濃度的 1/5 倍；
2) 精密量取上述對照品溶液 160 μL ，置于試管中，加入稀釋后的 A 溶液 100μL 和稀釋后 的 B 溶液 100 μL，搖勻，室溫反應 60min；然后加入正己烷溶液 400μL 旋緊蓋子后振搖 5~ 10s ，室溫靜置分層，取下層 200μL 溶液，加入800μL 水混合均勻，再取 200μL 加入 800μL 水混合均勻，用孔徑為 0.22μm 有機膜過濾，待分析；
3)供試品的衍生步驟與對照品相同，樣品衍生后稀釋體積可根據樣品中氨基酸含量適當稀釋。(注意：供試品樣品前處理采用酸解提取，需要在衍生之前進行酸揮干處理，供試品中酸性強度過大在衍生過程中會發生中和，衍生過程必須在堿性條件下，才能夠起到衍生化完全。)
四. 色譜條件
1. 色譜柱：CH 氨基酸專用柱 Amino Acid 5um 4.6X250
2. 梯度程序：
流動相 A：0. 1mol/L 醋酸鈉溶液 (pH 6.50) ：乙睛＝93：7
流動相 B：水：乙腈＝20：80
T(min) | A% | B% |
0.01 | 100.0 | 0.0 |
11 | 93 0 | 7 0 |
13.9 | 88.0 | 12.0 |
14 | 85.0 | 15.0 |
29 | 66.0 | 34.0 |
32 | 30.0 | 70.0 |
35 | 0 0 | 100 0 |
42 | 0.0 | 100.0 |
45 | 100.0 | 0.0 |
60 | 100.0 | 0.0 |
流 速：1.0mL/min
柱 溫：40℃
波 長：254nm
進樣量：10μL
工作站記錄時間：60min
色譜圖：CH 氨基酸專用柱 Amino Acid 5um 4.6X250
1. 門冬氨酸 2.谷氨酸 3.絲氨酸 4.甘氨酸 5.組氨酸 6.精氨酸 7. 蘇氨酸 8. 丙氨酸 9.脯氨酸
10．氯化銨 11.酪氨酸 12.纈氨酸 13.蛋氨酸 14.胱氨酸 15. 異亮氨酸 16. 亮氨酸17. 正亮氨酸
18. 苯丙氨酸 19. 賴氨酸
五. 操作步驟和注意事項
1. 操作步驟：
1) 設置柱溫 40℃和流速 1.0mL/min；
2) 將 A 、B 兩個通道用乙腈：水＝20：80 排盡氣泡 (如 B 通道的原存留液中不含緩沖 鹽，則無需用乙腈：水＝20：80 排氣泡) ，B 通道用流動相 B 再排盡氣泡；
3) 用乙腈：水＝20：80 (A 通道) 沖洗系統 20min ，以防止緩沖鹽析出；
4) A 通道用流動相 A 排盡氣泡，然后用流動相 A 走基線 30min ，平衡色譜柱；
5) 運行一次空白梯度；
6) 進樣分析；
7) 分析完成后：
I) 用乙腈：水＝20：80 代替流動相 A ，進水樣 (清洗自動進樣器) ，進行梯度洗脫；
II) 換 90％乙腈沖洗色譜柱 40min 以上；
2. 注意事項：
1) 進樣分析：先進對照品溶液，后進供試品溶液；
2) 緩沖溶液，隔天需重新配制；
3) 防止緩沖鹽析出。
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